实时荧光定量PCR 的原理及实验无论是对遗传病（如地中海贫血和血友病）、传染病（如肝炎和艾滋病）或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量per 技术都可以发挥很大作用。定量per 技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测per 产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到per 每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定et 值，从而根据et 值确定起始dna拷贝数，做到了真正意义上的dna 定量。这是dna 定量技术的一次飞跃。根据最终得到的数据不同，定量per 可以分为相对定量和绝对定量两种。 典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量per 又可以分为taqman 探针和sybr green i 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据

实时荧光定量pcr技术原理与应用一、 实时荧光定量PCR技术原理(1)实时荧光定量PCR技术是一种基于核酸扩增和荧光检测的分子生物学技术。其基本原理是在PCR反应过程中利用荧光物质对PCR产物进行实时监测，通过分析荧光信号的强度来定量目的DNA或RNA的拷贝数。该技术通过在PCR反应体系中加入荧光标记的寡核苷酸探针，当探针与目标DNA结合并经历PCR扩增后，荧光标记物会发出荧光信号。通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进程，从而实现对目标DNA或RNA的定量分析。(2)实时荧光定量PCR技术通常采用SYBRGreenI荧光染料或特异性探针两种方式进行检测。SYBRGreenI荧光染料是一种非特异性荧光染料，它能够与双链DNA结合并发出荧光，当PCR反应产生双链DNA时，荧光强度会增加。而特异性探针则是一种荧光标记的寡核苷酸，它能够与目标DNA序列特异性结合，并在结合过程中发生荧光信号的释放。通过比较不同样本的荧光信号强度，可以计算出目标DNA或RNA的初始拷贝数。(3)实时荧光定量PCR技术的关键步

01导读PCR是1984年开始出现的一项基因检测技术，由于PCR技术具有简便易行、敏感度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究和临床检测，成为分子生物学必要的研究工具。传统的PCR定量是应用终点PCR来对样品中的模板量进行定量，通常用凝胶电泳分离，并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物。但在PCR反应中，由于反应体系和反应条件等因素会影响PCR反应效率,甚至出现一些非特异性扩增产物。因此，用终点PCR法来定量并不准确。实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qPCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新的定量技术，该技术克服了PCR法进入平台期后定量的较大误差问题,实现DNA/RNA的精确定量，而且具有敏感度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面都有着重要的意义。02基本原理在PCR反应过程中，每经过一个循环,PCR产物量增加.相应的荧光信号强度也跟着增加,此时收集一个荧光强度信号。经过若干个循

实时荧光定量PCR原理与应用提纲•PCR•荧光定量PCR原理和基本概念•荧光监测物质•荧光定量PCR应用传统PCR传统PCR传统PCR传统PCR通过凝胶电泳对终产物进行定性分析(30　cycles)PCR:理论vs.实际Theoretical•In　theory,　PCR　reactionsamplify　exponentially,doubling　every　cycle　andgrow　forever.increaseRealityLog　TargetDNA•In　reality,Cycle　#普通PCR终产物分析定量不准确108106104102100倍稀释提纲•PCR•荧光定量PCR•荧光监测物质•实时荧光定量PCR应用定量PCR通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析模板F每个循环都检测一次荧光Cycle　12X模板FFCycle　2FF4X模板FF本底期、指数扩增期、平台期F荧光监测化学物质LinearView30-40循环荧光检测定量PCR通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析模板F本底期、指数扩增期、平台期Cycle　12X模板FFViewLogCycle　2F荧光检测F4X模板FFF荧光监测化学物质30-40循环荧光阈值与Ct值•荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)，软件会默认一个值，自动设置是

实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。一、原理概述2.定量PCR常用的三个常用概念扩增曲线、荧光阈值、Ct值(1).扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动录荧光强度的变化每个循环进行一次荧光信号的收集一、原理概述2.定量PCR常用的三个常用概念扩增曲线、荧光阈值、Ct值(2).荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动设置的

聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图(如图1，2)。图1实时荧光扩增曲线图图2实时荧光扩增曲线图一般

5 82 Chin J Hemorh．20 14；24(4) doi：10．3969~．issn．1009—881X ．2014．04．04 1 实时荧光定量PCR技术 的原理 、流程 以及 应用 刘萌 ，董亮 ( 苏州大学唐仲英血液学研 究中心 ，江苏 苏州 2 15123 ) 摘要 ：实时荧 光定 量PCR ( Real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR ) 具有特异性强 、灵敏度高 、重复 性好 、定量准确 、速度快 、全封 闭反应 等优 点 ，而被广泛应用 于基 础研 究 、疾病研究 、肿瘤 的诊断 等方 面 ，成为分子生物 学研 究中的重要工具 。该文对实 时荧光定量PCR技术的原理 、检测流程及其应 用进行 了综述 。 关键词 ：实时荧光定量PCR ；原理 ；流程 ；应用 中图法分类号 ：R523．1 文献标 识码 ：A 文章编号 ：1009—881X(2014)04—0582—03 Introduction and Application of Fluorescence Q uantitative Polymerase C hain R ea ct io n L I U M eng, D O NG L iang (Hematology Center, Cyrus Tang Medical Institute，Soochow University, Suzhou，Jiangsu，2 1 5 1 23，China) Abstract ：Real time fl uorescence quantitative PCR (RT-qPCR) with many advantages，such as strong sp eci fi city

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)提纲：实时荧光定量PCR原理数学原理化学原理实时荧光定量PCR的方法应用绝对定量相对定量定量PCR的实验要素平台定量PCR仪器介绍实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。与普通PCR的区别普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT 值（threshold value）。 定量PCR的数学原理斜率与扩增效率荧光定量PCR化学原理非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan1、SYBR Green 法SYBR Green 熔解曲线分析SYBR Green法优缺点优点:对DNA模板没有选择性

两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30^{\circ}C孵育2到3分钟。4下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30孵育10分钟后,于4下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75 \% 乙醇(75 \% 乙醇用DEPCH_{2}O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4下7000rpm离心5分钟。RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80^{\circ}C待用。2RNA质量检测1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释

实时荧光定量PCR技术的原理及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR技术（Real-Time Fluorogenic Quantitative PCR，简称qPCR）是一种基于PCR扩增过程中荧光信号实时检测的核酸定量技术。该技术结合了PCR的高效扩增能力和荧光信号的精准检测，实现了对DNA或RNA样本的精确定量分析。自上世纪90年代末期以来，实时荧光定量PCR技术已成为分子生物学领域的重要工具，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析、基因拷贝数测定等多个领域。本文将对实时荧光定量PCR技术的原理、实验方法、优缺点以及应用前景进行深入探讨，旨在帮助读者更好地理解并掌握这一关键技术。二、实时荧光定量PCR技术的原理实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称RT-qPCR）是一种基于PCR扩增过程中荧光信号的实时检测，对特定DNA或RNA序列进行定量分析的分子生物学技术。其原理主要依赖于PCR扩增过程中DNA双链的合成与荧光信号的产生之间的同步性。RT-qPCR技术中，常用的荧光染料或探针主要有两种类型：荧光染料和特异

聚合酶链式反应，是指在体外，酶促合成特异性DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火和适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时的特点。DNA聚合酶以单链DNA为模板，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。PCR反应条件PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。温度与时间的具体分析变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使

实时荧光定量PCR原理及其应用实时荧光定量PCR是一种在生物医学领域广泛应用的技术，它的主要原理是通过荧光染料或探针标记DNA片段，利用特殊的仪器探测荧光信号的强度，从而实现对DNA浓度的定量检测。这种技术的出现，不仅提高了核酸检测的准确性和灵敏度，还为医学、农业、工业等领域的研究和应用提供了强有力的工具。实时荧光定量PCR的反应体系主要包括模板DNA、引物、酶、dNTPs以及荧光染料或探针。在反应过程中，引物与模板DNA结合，通过酶的作用进行延伸，同时荧光染料或探针标记的荧光基团被激发出荧光信号。通过检测荧光信号的强度，可以实现对DNA浓度的定量检测。实时荧光定量PCR的应用非常广泛，在医学领域中，它被用于检测和诊断遗传性疾病、癌症、病毒感染等疾病。例如，通过对特定基因的表达水平进行检测，可以评估癌症的病情和预后。在农业领域中，实时荧光定量PCR被用于检测转基因作物、研究植物基因表达等。在工业领域中，实时荧光定量PCR被用于食品质量控制、

概述实时荧光定量PCR（Realtime Quantitative PCR）技术是一种基于荧光信号实时检测DNA或RNA扩增过程的分子生物学方法。该技术通过引入荧光标记的探针或染料，实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，从而实现对目标核酸序列的定性和定量分析。实时荧光定量PCR技术的出现，极大地提高了PCR技术的灵敏度和准确性，为分子生物学研究和临床应用提供了强有力的工具。实时荧光定量PCR技术自问世以来，经过不断的优化和改进，已经成为一种高效、可靠、自动化的核酸检测方法。其应用领域广泛，包括基因表达分析、病原微生物检测、遗传病诊断、药物研究等多个方面。通过实时荧光定量PCR技术，研究人员可 实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR（Realtime Quantitative PCR，简称qPCR）技术，作为分子生物学领域的一种革命性工具，其原理主要基于PCR扩增过程中的荧光信号实时监测。这一技术的核心在于将荧光基团加入PCR反应体系，使得荧光信号的强度与PCR产物的量直接相关。通过实时监测荧光信号的变化，我们可以精确地了解PCR反应的进程，并对目标DNA或RNA进行定量分析。在实时荧光定量PCR中，常用的荧光信号检测方法包括SYBR Green I法和TaqMan探针法。SYBR Green I法利用荧光染料特异性地掺入DNA双链后发射荧光信号，其强度与PCR产物的量成正比。而 实时荧光定量PCR的技术优势与局限性实时荧光定量PCR作为一种高效、灵敏的分子生物学技术，在多个领域展现出了显著的技术优势。该技术具有高度的灵敏性和特异性，能够准确检测极低浓度的目标核酸序列，从而实现对病原体、基因表达水平等的精确分析。实时荧光定量PCR能够实现快速检测，大大缩短了实验周期，提高了检测效率。该技术还具有高度的可重复性和准确性，为科研和临床诊断提供了可靠的数据支持。实时荧光定量PCR技术也存在一定的局限性。该技术对实验设备和操作技术要求较高，需要专业的实验人员和精密的仪器设备。这在一定程度上限制了其在基层医疗机构和现场快速检测中的应用。实时荧光定量PCR对引物和探针的设计要求较高，不合理的引物和探针设计可能导致实验结果的假阳性或假阴性。 实时荧光定量PCR的应用领域实时荧光定量PCR技术，以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确的显著优点，在众多科学领域中得到了广泛应用。尤其在近年来，随着技术不断优化和完善，实时荧光定量PCR的应用领域也在不断扩大和深化。在基础研究方面，实时荧光定量PCR已经成为基因表达分析、基因型鉴定、突变检测以及基因组拷贝数变异等研究的重要工具。通过精确测定特定基因的表达水平，研究人员可以深入了解基因的功能和调控机制，为揭示生命现象的奥秘提供有力支持。在临床诊断领域，实时荧光定量PCR技术同样发挥着举足轻重的作用。其高灵敏度和高特异性使得该技术能够准确检测病毒、细菌、真菌等微生物的核酸，为感染性疾病的快速诊断提供有力依据。 实时荧光定量PCR的研究进展与趋势近年来，实时荧光定量PCR技术以其高度的灵敏性、特异性和定量准确性，在生物学、医学、农学等多个领域得到了广泛的应用。随着科研技术的不断进步，实时荧光定量PCR的研究也取得了显著的进展，并呈现出一些新的发展趋势。在实时荧光定量PCR的技术优化方面，研究者们通过改进引物设计、优化反应体系、提高扩增效率等手段，进一步提升了实时荧光定量PCR的性能。同时，新的荧光染料和荧光探针的开发也为实时荧光定量PCR的应用提供了更多的选择。实时荧光定量PCR的应用范围也在不断拓宽。除了传统的基因表达量分析、病原体检测等领域外，实时荧光定量PCR还开始应用于基因突变检测、基因分型、药物代谢研究等新兴领域。 结论实时荧光定量PCR技术以其高灵敏度、高特异性、高精确度以及高自动化程度等优点，在现代分子生物学领域发挥着越来越重要的作用。该技术通过引入荧光化学物质，实时监测PCR反应中每一个循环产物的荧光信号，实现了对起始模板的定量及定性分析。在实时荧光定量PCR的应用方面，其已经渗透到多个领域，包括医学诊断、环境监测、食品安全等。例如，在医学诊断中，实时荧光定量PCR技术可用于病毒、细菌等病原体的快速检测与定量分析，为临床诊断和治疗提供了有力支持。该技术还可用于基因突变检测、基因表达差异分析等方面，为科研工作者提供了强大的研究工具。实时荧光定量PCR技术也面临着一些挑战和限制，如引物和探针的设计、荧光信号的稳定性以及操作过程中的污染问题等。

(Real time Quantitative PCR)定量定量相对定量绝对定量化学原理数学原理PCRPCR平台定量平台定量提纲：实时荧光定量PCRPCR实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCR的实验要素的实验要素仪器介绍仪器介绍原理的方法应用的方法应用实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。与普通PCR的区别普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。始模板进行定量。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT 值（threshold value）。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10 倍。定量PCR的数学原理斜率与扩增效率荧光定量PCR化学原理非特异性荧光标记：SYBR Green 特异性荧光标记：TaqMan1、SYBR Green 法SYBR Green 熔解曲线分析